细胞表型实验——细胞克隆

一、 核心概念：什么是细胞克隆？

           细胞克隆 指的是通过无性繁殖的方式，由一个共同的祖先细胞分裂、增殖而形成的一群基因型完全相同的细胞群体。

简单来说，就是 “复制粘贴”细胞。这群细胞：

1.基因型完全相同：它们拥有完全一致的遗传物质（DNA）。

2. 来源于一个祖先细胞：它们都是由最初的那个单一细胞分裂而来的。

二、 细胞克隆的基本原理与流程

          在实验室中，最常用的细胞克隆技术是 有限稀释法。其基本原理是：通过将细胞高度稀释，并分配到多个培养孔中，使得 statistically（统计上）每个孔中只含有一个细胞，由这个单一细胞增殖形成的细胞群体就是一个克隆。

以下是详细的步骤和原理：

流程步骤：

1. 准备细胞悬液：

         ● 首先，需要获得你想要克隆的细胞。这些细胞可能是经过基因改造的、能够分泌特定抗体的B淋巴细胞，或者是从肿瘤中分离出的、具有特殊性质的细胞等。

         ● 用胰蛋白酶等消化液将贴壁细胞从培养瓶壁上消化下来，制成单细胞悬液。

2. 细胞计数与稀释：

         ● 对细胞悬液进行计数，精确知道每毫升溶液中有多少个细胞。

         ● 关键步骤：进行一系列倍比稀释，最终将细胞浓度稀释到极低的水平，例如 每毫升10个细胞 或更低。

3. 铺板与培养：

         ● 将稀释后的细胞悬液接种到96孔板中。根据统计学原理（泊松分布），当细胞浓度足够低时，绝大多数孔中要么没有细胞，要么只有一个细胞，只有极少数孔会有两个或以上细胞。

         ● 通常，会向每个孔中加入条件培养基（即其他活跃生长的细胞培养过一段时间的上清液），其中含有丰富的生长因子和营养物质，有助于单个细胞的存活和生长。

4. 筛选与标记：

         ● 将细胞培养板放在显微镜下观察，标记出那些确认只有一个细胞的孔。这是确保克隆纯正性的关键一步。

5. 克隆扩增：

         ● 将标记出的单细胞孔继续培养。这个单一的“始祖细胞”会不断分裂、增殖，几周后形成一个可见的细胞团（克隆）。

         ● 当克隆长满孔底的大部分区域时，将其消化并转移到更大的培养容器中（如24孔板、6孔板，最后是培养瓶），进行扩大量养。

6. 鉴定与保种：

         ● 对扩增后的细胞群进行鉴定，确认其是否具有目标特性（如分泌特定抗体、表达特定蛋白等）。

         ● 将鉴定成功的阳性克隆进行冻存，建立细胞株。

三、 为什么单个细胞能长成一个克隆？—— 核心生物学原理

细胞克隆成功的背后，是细胞的两个基本生物学特性：

1. 细胞全能性/自我更新能力：

         ● 对于许多细胞类型（尤其是干细胞和某些已分化的细胞），单个细胞具备完整的遗传信息和细胞器，能够在适宜的条件下启动细胞周期，进行有丝分裂。

         ● 一个细胞分裂成两个，两个分裂成四个……如此指数级增长，最终形成由成千上万个细胞组成的群体。

2. 细胞分裂与增殖：

         ● 在提供了合适的培养基（包含葡萄糖、氨基酸、维生素等）、血清（提供生长因子和激素）、温度（通常37℃）、湿度和二氧化碳浓度（维持pH值）的环境下，细胞会持续进行有丝分裂，完成其生命周期。

四、 细胞克隆的应用

细胞克隆技术是生物医学研究和新药开发中不可或缺的工具。

       ●  单克隆抗体制备：这是最著名的应用。通过将分泌特定抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合，然后进行克隆化培养，筛选出能持续分泌单一、高纯度抗体的杂交瘤细胞株。

       ●  干细胞研究：分离和扩增具有多向分化潜能的单一干细胞，用于研究发育生物学和再生医学。

       ●  基因功能研究：在基因转染后，通过克隆筛选获得稳定表达外源基因的细胞株，用于研究该基因的功能。

       ●  癌症研究：从肿瘤组织中分离具有不同特性的癌细胞亚群（克隆），研究肿瘤的异质性和耐药机制。

       ●  稀有细胞系的建立：从混合细胞群体中分离出稀有的、具有特殊功能的细胞。

总结

         细胞克隆的原理核心在于：利用统计学稀释方法，将细胞分离成单个个体，并在最适的培养条件下，利用细胞自身的分裂增殖能力，使其发展成为一个遗传背景完全一致的纯系细胞群体。 这项技术是现代生物学研究和生物技术产业发展的基石。

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