CCK-8细胞活性检测——药物筛选

一、概述：CCK-8法在药物筛选中的应用

           CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一种基于水溶性四唑盐（WST-8）的比色法，广泛应用于细胞增殖和毒性检测。在药物筛选中，它通过快速、灵敏地评估候选药物对细胞活性的影响（是抑制还是促进），来筛选出有潜力的药物分子。

基本原理：

1. 反应过程： 活细胞线粒体内的脱氢酶会将CCK-8溶液中的WST-8还原为高度水溶性的橙色甲臜（Formazan）染料。

2. 定量关系： 生成的甲臜染料量与活细胞的数量成正比。细胞活性越高，脱氢酶活性越强，产生的甲臜就越多，颜色也就越深。

3. 检测读取： 使用酶标仪在450nm波长下测量吸光度（OD值），OD值的高低直接反映了细胞活性的强弱。

二、实验步骤（以96孔板筛选抗癌药物为例）

第一阶段：实验设计与准备

1. 细胞选择与培养：

   ○  选择与筛选目的相关的细胞系（例如，筛选抗癌药物使用癌细胞系，如HeLa、A549等）。

   ○  确保细胞处于对数生长期，状态良好，无污染。

2. 药物准备：

   ○  将待筛选的药物母液用适当的溶剂（如DMSO、PBS或培养基）进行系列稀释，以设置一个浓度梯度（例如，从10μM到0.1nM，共7个浓度）。关键： 确保溶剂的最终浓度对细胞无毒性（通常DMSO < 0.1%）。

   ○  设置一个溶剂对照组（只加等量溶剂，不加药物），以排除溶剂本身的影响。

3. 实验分组设计：

   ○  空白对照组： 只有培养基，不加细胞。用于校正背景吸光度。

   ○  阴性对照组（0%抑制）： 只加细胞和培养基（及等量溶剂）。代表100%细胞活性。

   ○  阳性对照组（100%抑制）： 加入已知能完全杀死细胞的药物（如高浓度顺铂或Staurosporine）。代表0%细胞活性。

   ○  药物处理组： 加入不同浓度的待测药物。

第二阶段：实验操作

1. 铺板：

   ○  消化、重悬细胞，并计数。将细胞悬液调整到合适的密度。

   ○  将细胞悬液接种到96孔板中，通常每孔加入100μL。铺板细胞数至关重要，需通过预实验确定，保证在实验结束时对照组细胞未长满（通常使终止培养时OD值在0.8-1.2之间线性关系最佳）。

   ○  空白对照组孔中加入等体积的培养基（无细胞）。

   ○  将培养板放在37°C、5% CO₂培养箱中预培养24小时，让细胞贴壁并进入稳定状态。

2. 加药处理：

   ○  24小时后，吸去（或直接小心加入）旧培养基，换为含有不同浓度药物的新鲜培养基。每个浓度建议设置3-6个复孔以确保统计学意义。

   ○  轻轻晃动培养板使其混匀。

   ○  放回培养箱，继续培养24-72小时（根据药物作用机制和实验目的确定）。

3. CCK-8检测：

   ○  配制CCK-8工作液：按每孔培养基体积的10% 加入CCK-8试剂。例如，每孔有100μL培养基，则加入10μL CCK-8原液。

   ○  重要： 为避免产生气泡，建议使用多通道移液器沿孔壁缓慢加入。

   ○  加完后，轻轻敲击板壁使其充分混匀。

   ○  将培养板放回培养箱，避光孵育 1-4小时。孵育时间需要通过预实验摸索，以阴性对照孔的OD值达到0.8-1.5为宜。

4. 吸光度检测：

    ○  使用酶标仪，在450nm波长下测量各孔的吸光度（OD值）。

第三阶段：数据分析与结果解读

1. 数据计算：

   ○  计算各组复孔的平均OD值。

   ○  细胞活力计算：
细胞活力 (%) = [(OD药物组 - OD空白组) / (OD阴性对照组 - OD空白组)] × 100%

2. 结果呈现：

   ○  将细胞活力（%）对药物浓度（通常取对数）进行非线性拟合。

   ○  IC₅₀（半抑制浓度） 是指抑制50%细胞活力所需的药物浓度，是评价药物效力的关键指标。IC₅₀值越低，表明药物的效力越强。

   ○  使用GraphPad Prism、Origin等软件可以轻松进行曲线拟合和IC₅₀计算。

   ○  柱状图： 直观比较不同药物浓度下的细胞活力。

   ○  剂量-反应曲线与IC₅₀计算：

三、优势与注意事项

优势：

●  高灵敏度： 检测限低，可用于少量细胞的检测。

●  操作简便： "加样-孵育-检测"三步完成，无需洗涤细胞。

●  安全性高： 无需使用放射性物质或剧毒试剂（如MTT中的结晶紫）。

●  重现性好： 生成的甲臜染料水溶性好，结果稳定。

●  适用于高通量筛选： 易于实现自动化操作。

关键注意事项：

1. 避免气泡： 气泡会严重干扰OD值读数。

2. 铺板均匀性： 细胞铺板不均匀是最大的误差来源。确保细胞悬液混合均匀。

3. 孵育时间： CCK-8孵育时间过长会导致颜色过深，超出酶标仪的线性范围。必须通过预实验优化。

4. 药物干扰： 某些药物本身具有颜色或氧化/还原性，可能会干扰检测结果。需要设置药物背景对照组（含药物和培养基，不加细胞）来排除干扰。

5. 无菌操作： 加CCK-8时虽无需严格无菌，但前期细胞培养和加药过程必须无菌。

6. 细胞状态： 细胞的传代次数和状态直接影响实验结果的可重复性。

总结

         CCK-8法因其简便、快速、灵敏和安全的特点，已成为药物筛选（尤其是初筛）中评估细胞活性的金标准方法之一。通过严谨的实验设计、规范的操作和准确的数据分析，您可以高效地筛选出具有生物活性的候选药物，并初步评估其效力（IC₅₀），为后续的深入研究奠定坚实基础。

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