CCK-8细胞活性检测——细胞毒性测定

一、核心原理

“酶-底物”反应

    1. 关键酶： 存在于活细胞线粒体中的脱氢酶。这些酶在细胞能量代谢（如三羧酸循环）过程中具有活性。只有活细胞才拥有具有代谢活性的脱氢酶。

    2. 关键底物： CCK-8试剂中的 WST-8。

           ●  WST-8 的化学名是：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐。

           ●  它是一种高度水溶性的四唑盐，本身接近无色。

3. 反应过程：

      ●  将CCK-8试剂加入到培养的细胞中。

      ●  活细胞中的脱氢酶会催化WST-8发生还原反应。

      ●  在这个反应中，脱氢酶会将辅酶I（NAD+） 还原为还原型辅酶I（NADH），而生成的NADH或NADPH又作为氢的传递体，最终将WST-8（四唑盐，接受电子）还原。

      ●  还原后的WST-8生成一种橙黄色的、高度水溶性的甲瓒（Formazan）染料。

4. 检测与量化：

      ●  生成的橙色甲瓒染料的数量与培养基中活细胞的数量成正比。

      ●  使用酶标仪在 450 nm 波长处检测该溶液的吸光度（OD值）。

      ●  吸光度值越高，意味着生成的甲瓒越多，也就代表活细胞数量越多。

二、细胞毒性测定原理

 细胞毒性测定是基于细胞活性测定的反向推导。

     1. 实验设计：

         ●  实验组： 用待测药物/化合物处理的细胞。

         ●  对照组： 未经处理的正常细胞（通常设其细胞活力为100%）。

         ●  将细胞分为两组：

         ●  在相同条件下培养一定时间后，分别向两组细胞中加入等量的CCK-8试剂。

2. 结果分析与计算：

    ●  如果待测化合物具有细胞毒性，会导致细胞死亡或代谢活性下降。

    ●  与对照组相比，实验组细胞中的脱氢酶活性降低，因此还原WST-8的能力下降，生成的橙色甲瓒减少，测得的OD值较低。

    ●  通过比较两组的OD值，可以计算出待测物对细胞的毒性作用。

细胞活力计算公式：
 细胞活力 (%) = [ (As - Ab) / (Ac - Ab) ] × 100%

●  As: 实验孔（含细胞、CCK-8试剂和待测药物）的吸光度。

●  Ac: 对照孔（含细胞、CCK-8试剂，不含药物）的吸光度。

●  Ab: 空白孔（含培养基和CCK-8试剂，不含细胞）的吸光度。用于扣除背景。

细胞毒性：
细胞毒性 (%) = 100% - 细胞活力 (%)

 如果细胞活力显著低于100%，则说明待测物具有细胞毒性。

三、CCK-8法的优势（相比于传统的MTT法）

1. 高灵敏度： WST-8被还原的效率更高，信号更强。

2. 操作简便，一步法： CCK-8试剂直接加入培养基中，无需更换培养基，也无需后续的溶解步骤（而MTT法生成的甲瓒不溶于水，需要加入DMSO等有机溶剂溶解，步骤繁琐且易引入误差）。

3. 重现性好： 由于甲瓒产物是水溶性的，不会在细胞内形成结晶，因此颜色均匀，结果稳定，重现性高。

4. 对细胞无毒： CCK-8试剂本身对细胞毒性极低，因此可以在加入试剂后继续培养细胞，进行长时间的连续观测或动力学监测。

5. 安全性高： 无需使用放射性物质或剧毒有机溶剂。

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