CCK-8细胞活性检测——细胞增殖测定

一、核心原理概述

          CCK-8法的核心原理是：利用一种高水溶性的四唑盐（WST-8），在活细胞线粒体内脱氢酶的作用下，被还原生成高度橙黄色的甲臜（Formazan）染料。生成的甲臜染料量与活细胞的数量成正比。因此，通过测量溶液在450nm处的吸光度，就可以间接反映活细胞的数目和活性。

二、详细原理分步解析

1. 关键组分：CCK-8试剂

CCK-8试剂盒主要包含一种叫做 WST-8 的化学物质。

        ● WST-8：化学名是 2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐。它是一种高度水溶性的四唑盐。

2. 反应过程

当将CCK-8试剂加入到培养的细胞中后，会发生以下关键反应：

●  第一步：进入细胞
WST-8分子很小，可以穿过细胞膜进入活细胞内。

●  第二步：酶促还原反应（核心步骤）
在活细胞的线粒体中，存在一系列高效的脱氢酶，特别是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD/NADH） 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP/NADPH） 相关的代谢酶系统。

            ●  活细胞在进行新陈代谢（如糖酵解、三羧酸循环）时，会不断地产生电子载体，如 NADH 和 NADPH。这些物质具有很强的电子供给能力。

            ●  WST-8进入细胞后，在脱氢酶的催化下，会接受来自NADH或NADPH的电子，发生还原反应。

●  第三步：生成可检测信号
被还原的WST-8会从无色的四唑盐，转变为一个高度水溶性的、橙黄色的产物，叫做甲臜（Formazan）。

            ●  关键点：这个甲臜染料是水溶性的，可以直接溶解在细胞培养液中，不需要像传统的MTT法那样额外加入有机溶剂（如DMSO）来溶解，这使得操作步骤大大简化，并可以实现实时、动态监测。

●  第四步：信号检测
将培养板放入酶标仪中，在450nm波长下测量吸光度。生成的橙黄色甲臜染料越多，溶液颜色越深，在450nm处测得的吸光度值就越高。

3. 定量关系

          活细胞数量越多 → 细胞内的脱氢酶活性总量越高 → 被还原的WST-8越多 → 生成的甲臜染料越多 → 在450nm处的吸光度值越高。

           通过绘制已知细胞数量的标准曲线，就可以根据样品的吸光度值，精确计算出待测样品中的活细胞数量。

三、CCK-8法的主要优势

与传统的MTT法相比，CCK-8法具有显著优点：

1. 高灵敏度：WST-8被还原的效率比MTT更高，产生的信号更强，因此可以检测到更少数量的细胞。

2. 操作简便：生成的甲臜染料是水溶性的，无需换液和溶解步骤，只需“加入-孵育-检测”三步，大大减少了操作时间和误差。

3. 重现性好：由于减少了操作步骤，实验结果更稳定，重复性更高。

4. 安全性高：WST-8及其产物的毒性远低于MTT，对细胞的影响更小。

5. 适合高通量筛选：简便的操作使其非常适合用于96孔板或384孔板的大规模药物筛选实验。

6. 可实时监测：可以在不同时间点对同一批细胞进行连续检测，以绘制细胞生长曲线。

四、应用场景

CCK-8法主要用于：

●  细胞增殖/毒性检测：评估药物、化合物或环境因素对细胞生长的影响（抑制或促进）。

●  药物筛选：大规模筛选具有抗癌、抗菌等活性的候选药物。

●  肿瘤敏感性测定：测试不同化疗药物对特定肿瘤细胞的效果。

●  细胞因子活性测定：研究某些因子是否能促进或抑制细胞生长。

●  生物材料相容性评估：评估植入材料对细胞活性的影响。

总结

          CCK-8法的原理，一言以蔽之，就是利用活细胞线粒体内的脱氢酶，将外源加入的无色WST-8还原成水溶性的黄色甲臜，通过检测黄色的深浅来定量活细胞的数目和代谢活性。 其简便、灵敏、安全的特性使其成为现代细胞生物学和药理学研究中最主流的细胞活性检测方法之一。

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