流式细胞术检测——T细胞表型测定

         通过特异性抗体标记T细胞表面的特征性蛋白（即“表型”），然后让细胞排成单列高速流过检测器，用激光照射并分析荧光信号，从而对T细胞进行定性和定量分析。

核心原理概述

 “表型” 指的是T细胞表面表达的一组特定的蛋白质分子，主要是分化簇（CD）分子。例如：

●  CD3：所有T细胞共有的标志。

●  CD4：辅助性T细胞的标志。

●  CD8：细胞毒性T细胞的标志。

●  其他：如CD45RA（初始T细胞）、CD45RO（记忆T细胞）、CD25（活化T细胞/调节性T细胞）等。

         流式细胞术就是利用荧光素标记的特异性抗体，像“钥匙开锁”一样与这些“表型”蛋白（锁）结合，然后通过检测荧光信号来识别和计数不同类型的T细胞。

详细步骤与原理

第一步：样本制备与荧光抗体标记

1. 样本来源：获取待测细胞，如外周血单个核细胞（PBMC）、淋巴结细胞、脾细胞或组织浸润淋巴细胞等。

2. 抗体孵育：将细胞悬液与预先设计好的荧光抗体组合在避光条件下进行孵育。

        ●  多色荧光：现代流式细胞术通常使用多种不同荧光颜色的抗体同时标记。例如，用FITC（绿色）标记的抗-CD4抗体，用PE（红色）标记的抗-CD8抗体，用APC（远红色）标记的抗-CD3抗体。

        ●  原理：抗体与细胞表面相应的CD分子特异性结合，这样细胞就被“染”上了不同的颜色。

第二步：液流与检测

标记好的细胞被注入流式细胞仪，核心过程如下：

1. 液流聚焦：细胞悬液在鞘液的包裹和约束下，形成极细的液流，使细胞排成单列，逐个通过激光检测区域。这是保证检测准确性的关键。

2. 激光照射：当单个细胞流经激光束时，会被高强度的激光（通常是蓝色488nm激光，或其他如红色、紫色激光）照射。

3. 信号产生与收集：细胞被激光照射后，会产生多种信号，被不同的探测器接收：

        ●  细胞上结合的荧光抗体被激光激发后，会发射出特定波长的荧光。

        ●  这些荧光信号经过一系列滤光片（允许特定波长的光通过），被光电倍增管（PMT） 这类高灵敏度探测器接收。

        ●  每个荧光通道对应一种特定的荧光染料（即一种抗体）。

        ●  前向散射光（FSC）：与细胞的大小和体积相关。细胞越大，FSC信号越强。

        ●  侧向散射光（SSC）：与细胞内部的复杂程度（如颗粒度、核形）相关。细胞内部结构越复杂，SSC信号越强。

        ●  作用：通过FSC和SSC可以初步区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，从而在分析时“圈选”出淋巴细胞群体进行后续分析。

第三步：数据分析

探测器将光信号转换为电信号，再数字化为数据。通过专门的软件进行分析：

1. 设门（Gating）：这是流式数据分析的核心策略。

        ●  画出 CD3+ 的细胞（所有T细胞）。

        ●  在CD3+的细胞中，进一步分析 CD4+ 和 CD8+ 的细胞。

        ●  这样就可以精确计算出CD4+ T细胞和CD8+ T细胞在淋巴细胞中的百分比和绝对数量。

        ●  首先，在FSC-A vs SSC-A散点图上，根据大小和颗粒度圈出淋巴细胞群。

        ●  然后，在淋巴细胞门内，进行多色分析。例如：

2. 结果呈现：数据通常以散点图、等高线图或直方图的形式展示，可以非常直观地看到不同细胞亚群的比例和荧光强度。

技术优势

●  高通量：每秒可检测数千至上万个细胞，统计意义强。

●  多参数：可同时检测一个细胞上的多个（十几个甚至几十个）表型分子，信息量巨大。

●  定量：不仅能定性（有无），还能通过荧光强度半定量地分析某个蛋白的表达水平。

●  高灵敏度：能够检测到低丰度的细胞亚群（如调节性T细胞）。

●  可分选（流式分选）：在分析的基础上，可以将特定的目标细胞亚群（如CD4+ CD25+ T细胞）物理性地分选出来，用于后续培养、功能实验或测序等。

应用实例

通过流式细胞术检测T细胞表型，可以：

●  评估免疫状态：计算CD4/CD8比值。

●  诊断免疫缺陷病：如艾滋病患者CD4+ T细胞数量急剧下降。

●  监测自身免疫性疾病和肿瘤免疫。

●  研究T细胞的活化、分化和记忆状态。

        总结来说，流式细胞术检测T细胞表型的原理，就是利用抗原抗体特异性结合的原理，给细胞贴上“荧光标签”，再通过精密的光学系统和计算机分析，实现对混合细胞群体中特定T细胞亚群的快速、精准、多参数的识别和计数。

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