流式细胞术检测——T细胞总数测定

         流式细胞术检测T细胞总数，本质上是利用特异性抗体对样本中的T细胞进行标记和识别，然后通过流式细胞仪进行快速、定量的分析。其核心是检测所有T细胞表面共同表达的标志物——CD3。因此，CD3+ 的淋巴细胞就被定义为总T细胞。

检测原理

1. 抗原抗体反应：使用带有荧光素的抗体（如FITC、PE等标记的抗CD3抗体）与细胞表面的CD3分子特异性结合。

2. 流体聚焦：被标记的细胞悬液在仪器中被鞘液包裹，形成单细胞流，依次通过激光检测区。

3. 光信号检测：

        ○  散射光：激光照射细胞会产生散射光。前向散射光反映细胞的大小，侧向散射光反映细胞的颗粒度和内部复杂度。通过FSC和SSC可以初步区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。

        ○  荧光：结合在细胞上的荧光抗体被激光激发，发射出特定波长的荧光。检测器会收集这些荧光信号。

4. 数据分析：计算机将光信号转化为电信号，通过软件进行分析，从而对CD3阳性的细胞进行计数和比例计算。

操作步骤

第一阶段：样本制备

1. 样本来源：外周血、骨髓、淋巴组织或培养的细胞。最常用的是人外周血。

2. 细胞分离：

        ○  红细胞裂解法：最常用的方法。将抗凝全血与红细胞裂解液混合，裂解红细胞，然后离心洗涤，获得富含白细胞的细胞悬液。

        ○  密度梯度离心法：使用Ficoll等分离液，分离出外周血单个核细胞，主要用于需要进一步培养或更纯净分析的场景。

3. 细胞计数：使用细胞计数板或自动细胞计数器对白细胞进行计数，以确定后续加样的细胞量。

第二阶段：荧光抗体标记

1. 设计抗体 panel：至少需要包含：

        ○  抗CD3抗体：用于识别总T细胞。

        ○  可选：设门抗体：如抗CD45（所有白细胞标志）和抗CD14（单核细胞标志）或使用FSC/SSC，有助于更精确地圈定淋巴细胞群。

2. 加样与孵育：

        ○  取一定数量的细胞（通常为10^5 - 10^6个）加入流式管。

        ○  加入预先优化好浓度的荧光抗体。

        ○  避光孵育15-30分钟（室温或4°C）。

3. 洗涤与重悬：

        ○  加入缓冲液（如PBS）离心，去除未结合的游离抗体。

        ○  弃上清，用固定液（如1-4%多聚甲醛）或含血清的PBS重悬细胞，准备上机。固定可以灭活病原体并稳定荧光信号。

第三阶段：流式细胞仪上机检测

1. 仪器校准：使用标准荧光微球进行光路和液路的校准，确保仪器处于最佳状态。

2. 样本上机：将制备好的细胞悬液放入仪器，细胞被吸入并进行分析，通常收集10,000-50,000个细胞事件。

3. 设置对照：这是保证数据准确性的关键！

        ○  阴性对照/同型对照：使用与特异性抗体同种属、同亚型、同标记但无目标特异性的抗体，用于设定荧光阴性与阳性的分界。

        ○  单阳性对照：每个荧光通道单独标记的样本，用于调节荧光补偿，消除不同荧光染料之间的光谱重叠。

第四阶段：数据分析

这是将原始数据转化为有意义结果的关键步骤。

1. 圈定淋巴细胞群：

        ○  在FSC-A vs SSC-A散点图上，根据细胞大小和颗粒度，圈出形态均一的淋巴细胞群。

        ○  更精确的方法：使用CD45 vs SSC设门，CD45强阳性且SSC低的细胞是典型的淋巴细胞。

2. 圈定CD3+ T细胞：

        ○  在淋巴细胞门内，绘制CD3荧光强度的直方图或散点图。

        ○  根据同型对照设定Marker，将CD3阳性表达的细胞圈定为总T细胞。

3. 结果读取：

        ○  百分比：分析软件会直接给出淋巴细胞门中CD3+细胞所占的百分比。

        ○  绝对计数：

                ○  方法一（双平台法）：将流式测得的百分比 × 临床血常规分析仪测得的淋巴细胞绝对计数。

                ○  方法二（单平台法）：在样本制备时，加入已知数量的计数微球。通过分析微球数量与细胞数量的比例，直接计算出CD3+细胞的绝对浓度。此法更准确、可重复性更好。

结果解读与临床意义

         ○  正常参考范围：人外周血中，总T细胞（CD3+）约占淋巴细胞的50%-84%，绝对计数约为600-2400个/μL。但各实验室应建立自己的参考范围。

         ○  临床意义：

                 ○  降低：常见于免疫缺陷状态，如艾滋病、先天性免疫缺陷病、放疗/化疗后、某些病毒感染（如流感、COVID-19重症）等。

                 ○  升高：常见于某些自身免疫病的活动期、慢性感染或T细胞白血病/淋巴瘤等。、

注意事项

1. 样本质量：抗凝剂的选择（推荐EDTA或肝素）、运输时间和温度、处理及时性都会影响结果。

2. 抗体选择与滴定：选择高质量的抗体，并进行预实验确定最佳使用浓度。

3. 荧光补偿：必须正确设置，否则会导致假阳性或假阴性结果。

4. 设门策略：一致的设门标准对结果的可靠性和可比性至关重要。

总结

       流式细胞术检测T细胞总数是一个成熟、高效、多参数的技术。通过特异性标记CD3分子，它可以精确地定量分析外周血或其他样本中总T细胞的相对比例和绝对数量，为临床评估机体细胞免疫功能状态提供至关重要的依据。在此基础上，还可以通过增加CD4和CD8抗体，进一步将T细胞分为辅助/诱导T细胞和细胞毒性T细胞等亚群，获得更深入的免疫信息。

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