流式细胞术检测——测定细胞周期

          流式细胞术检测细胞周期的基本原理是：利用能与DNA特异性结合的荧光染料对细胞进行染色，然后通过测量每个细胞中DNA含量的荧光强度，来区分处于不同周期（G0/G1期、S期、G2/M期）的细胞群。

详细步骤与原理分解

1. 样本制备与染色

  ○  细胞固定： 首先用乙醇或甲醛等固定剂穿透细胞膜并固定细胞内部结构，同时使DNA暴露出来。

  ○  染色： 加入能与DNA双螺旋结构特异性、化学计量结合的荧光染料。

          ○ 最常用染料： 碘化丙啶，它不能透过活细胞膜，但可嵌入固定后细胞的DNA/RNA双链中。

          ○ 关键处理： 为了排除RNA的干扰，染色前需要用RNA酶处理细胞，确保荧光信号只来自DNA。

          ○ 其他染料： DAPI、Hoechst 33342（后者可用于活细胞）。

2. 流式细胞仪检测

这是技术实现的核心环节。单个细胞在鞘液的包裹下，高速通过一个极细的流动室，形成“单细胞流”。

  ○  激发： 一束特定波长（如PI用488nm蓝光）的激光精确照射通过的单个细胞。

  ○  发射： 细胞内的PI染料被激发，发射出特定波长（如PI发射~617nm红光）的荧光。

  ○  检测： 探测器接收每个细胞发出的荧光信号，并将其转化为电信号。荧光的强度与细胞内的DNA含量成正比。

3. 数据分析与周期拟合

这是将原始数据转化为生物学信息的关键。

 ○  得到的数据： 一个以DNA荧光强度为横坐标、细胞数量为纵坐标的分布直方图。

 ○  直方图特征：

         ○ 第一个峰（低荧光强度）： 代表DNA含量为2C的细胞群，即G0/G1期细胞。

         ○ 第二个峰（高荧光强度）： 代表DNA含量为4C的细胞群，即G2/M期细胞。

         ○ 两峰之间的平坦区域： 代表DNA含量介于2C和4C之间的细胞群，即S期细胞。

 ○  软件拟合： 使用专用的细胞周期分析软件（如ModFit, FlowJo中的模块），对直方图进行数学建模和曲线拟合，从而精确计算出各时期细胞占总细胞的百分比。

         ○ G0/G1期百分比

         ○ S期百分比： 反映细胞DNA合成的活跃程度，是衡量细胞增殖的关键指标。

         ○ G2/M期百分比

关键要点与注意事项

 1. 化学计量结合： 这是原理成立的前提。染料必须与DNA含量严格按比例结合，才能保证荧光强度真实反映DNA含量。

 2. 区分G0期与G1期： 标准的DNA含量法无法区分静止的G0期和准备期的G1期细胞，因为它们的DNA含量相同。要区分它们，需要结合其他标记物，如Ki-67。

 3. 区分G2期与M期： 同样，DNA含量法无法区分G2期和M期细胞。可以通过同时标记M期特异性蛋白（如磷酸化组蛋白H3）来区分。

 4. 细胞团块干扰： 如果两个或多个细胞粘连在一起通过检测器，会被误认为是一个DNA含量很高的细胞，干扰G2/M峰的判断。数据分析时需要通过脉冲信号宽度排除这些“双联体”或“多联体”。

 5. 应用：

       ○  评估细胞增殖状态： 比较不同处理组（如药物处理、基因敲除）细胞周期分布的变化。

       ○  研究细胞周期调控机制。

       ○  肿瘤学研究： 肿瘤细胞的DNA含量（倍体性）常出现异常，出现非整倍体峰，可用于辅助诊断和预后判断。

总结

流式细胞术检测细胞周期的原理可以概括为一个清晰的逻辑链：

DNA含量周期性变化 → 利用荧光染料定量染色 → 流式细胞仪单细胞检测荧光强度 → DNA含量直方图分布 → 软件拟合计算出G0/G1期、S期、G2/M期细胞百分比。

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