干货：细胞实验之细胞毒性分析（CCK-8法）

一、实验原理

      以CCK-8法为例简述其原理:CCK-8试剂盒中含水溶性四唑盐WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐),

WST-8在电子载体1-Methoxy PMS存在的条件下，活细胞线粒体中的脱氢酶催化 WST-8生成高度水溶性的橙黄色甲瓒燃料，而甲臜染料的生成量与活细胞的数量成线性关系。

二、实验用途

1、药物筛选实验;

2、肿瘤药敏试验;

3、活性因子的活性检测;

4、细胞增殖测定等;

三、材料仪器

【材料试剂】细胞悬液，化合物溶液、CCK8试剂、完全培养基、PBS、

0.25%Trypsin-EDTA

【仪器用品]96孔板，二氧化碳培养箱，检测波长450-490nm酶标仪

四、实验步骤

1、根据具体细胞类型确定其在96孔板种植密度，以对照组细胞密度至检测时达到70%-90%为参照，每组设置3-6个复孔，孔板边缘空不用，加入与培养基等体积的无菌 PBS 溶液;

2.每孔加入培养基体积1/10的CCK-8溶液。若起始的培养体积为200微升，则需加入20微升 CCK-8溶液，其它情况以此类推。同时以加了相同体积细胞培养液和

CCK-8 溶液但没有细胞的孔作为空白对照。若所用药物会干扰检测结果，则选加入等体积细胞培养液、药物和CCK-8溶液但无细胞的孔作为空白对照(注意不可产生气泡);

3.在细胞培养箱内继续孵育2-4小时，建议选取2、3、4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验;

4.在450 nm测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600 nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。

五、注意事项

1、本实验使用96孔板进行检测，周围一圈最容易蒸发，检测会因体积不准确而增加误差故弃用周围一圈，加入等体积相同量的PBS、水或培养液;

2、本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，因而还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

3、用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定;

4、酚红和血清对CCK-8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去;

5、试剂有一定的毒性，请穿好实验服并戴一次性手套操作;

6、试剂要注意避光4oC或-20oC保存;

六、常见问题

1、如果细胞生长较慢，且细胞较小，可以最大接种1x104 cells/well，但加入化合物后处理时间最长为72h。

2、化合物如果难溶于水，可以在培养基中适当添加DMSO、DMF以助溶，但最大浓度不宜超过0.5%，因为DMSO和DMF对细胞也有一定的毒性。如果使用DMSO、 DMF助溶，需保证其他浓度的化合物DMSO、DMF的浓度也相同。

3、若吸光度值太低，怎么办法?
1)适当增加细胞数量;

2)延长加入CCK-8溶液后的孵育时间。

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