干货：手把手教你做实验之细胞冻存

       细胞冻存是一项非常基础和重要的细胞生物学实验技术，其核心目的是长期保存细胞，以便在需要时复苏使用，保持细胞的活性和遗传特性。下面为您提供一份详细、规范的细胞冻存实验操作指南。
一、 实验原理 细胞在低温（-196℃的液氮）下，细胞内的代谢活动几乎完全停止，从而实现长期保存。然而，直接冷冻会导致细胞内外的水形成冰晶，刺破细胞膜和细胞器，造成细胞死亡。 因此，细胞冻存的关键在于：
使用冻存液：通常含有 DMSO（二甲基亚砜） 或甘油等冷冻保护剂。这些试剂能降低水的冰点，减少冰晶的形成，并缓慢渗透到细胞内，帮助细胞脱水，减少内部冰晶。
缓慢降温：采用 “程序性降温” 或简易方法，控制降温速度（通常约-1℃/分钟），让细胞有足够的时间让水分渗出，避免细胞内产生大的冰晶。
二、 实验材料与试剂

细胞：处于对数生长期、生长状态良好的细胞（通常融合度在80%-90%）。
基础培养基：根据细胞类型选择（如DMEM, RPMI-1640等）。
血清：胎牛血清（FBS）。
冻存液： 标准配方：基础培养基 + 血清 + DMSO，
常用比例为 5:4:1。 例如：50% 培养基 + 40% FBS + 10% DMSO。
注意：DMSO对细胞有毒性，室温下操作需迅速。现用现配，或配好后4℃保存短期使用。
其他试剂：PBS缓冲液，胰蛋白酶（Trypsin）等消化液。

耗材： 冻存管（1.5mL或2mL，需耐低温）。 移液器及吸头。 离心管。

仪器设备： 超净工作台。 离心机。 倒置显微镜。 4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃超低温冰箱。 液氮罐（用于长期储存）。

程序降温盒（或称“细胞冻存盒”，内含异丙醇，可实现缓慢降温）。这是关键设备，如果没有，需要使用替代方法。

三、 实验步骤（详细操作流程）
准备工作 配制冻存液：按比例配制好冻存液，置于4℃冰箱预冷。DMSO在稀释时会产生热量，预冷可以减少对细胞的冲击。

标记冻存管：在冻存管上清晰标记细胞名称、代次、冻存日期、操作者姓名。
细胞处理 消化细胞：弃去旧培养基，用PBS轻轻清洗细胞1-2次。加入适量胰蛋白酶消化细胞，在显微镜下观察，待细胞变圆、间隙增大后，立即加入含血清的完全培养基终止消化。

制备单细胞悬液：用移液器轻轻吹打细胞培养皿底部，使细胞完全脱落并分散成单个细胞。 

细胞计数：取少量细胞悬液进行计数，调整细胞浓度。 

 离心：将细胞悬液转移至离心管中，800-1000 rpm离心5分钟。 

重悬：小心弃去上清液，用预冷的冻存液重悬细胞沉淀。 关键参数：细胞浓度。通常建议的最终浓度为 5×10^6 至 1×10^7 个细胞/mL。浓度过高或过低都会影响复苏存活率。
分装与冻存
分装：将细胞悬液快速、均匀地分装到标记好的冻存管中，每管约1-1.5 mL。盖紧管盖。
缓慢降温（最关键的一步！）： 最佳方法（使用程序降温盒）： 将冻存管立即放入充满异丙醇的程序降温盒中。 将整个盒子直接放入-80℃超低温冰箱中。 盒子内的异丙醇能确保细胞以约-1℃/分钟的理想速率缓慢降温。 在-80℃冰箱中放置 12-24小时 后，再迅速转移至液氮中长期保存。

简易方法（无程序降温盒）： 将冻存管置于 4℃冰箱 30分钟。 然后转移至 -20℃冰箱 1-2小时。 再转移至 -80℃超低温冰箱 过夜。 最后转移至液氮中。
注意：此方法降温速率不易控制，细胞存活率可能低于使用程序降温盒。
 长期储存 液氮储存：经过缓慢降温后，尽快将冻存管转移至液氮罐的气相（约-150℃）或液相（-196℃）中长期储存。务必做好详细的储存位置记录！
四、 注意事项 

细胞状态：一定要冻存生长旺盛、无污染的细胞。 

操作迅速：从加入冻存液到放入低温环境，动作要快，以减少DMSO在室温下对细胞的毒性。 

防爆：冻存管不能完全装满，需留出空间供液体冻结时膨胀，否则有破裂风险。 

防护：操作液氮时务必戴好防冻手套和护目镜，防止冻伤。 

定期检查：定期检查液氮罐的液位，及时补充液氮。 

 五、 常见问题与解决方案
1、复苏后细胞存活率低：
原因：冻存前细胞状态不佳；冻存液配方或浓度不当；降温速度不合适；复苏过程太慢。 

解决：确保使用对数生长期的细胞；优化冻存液配方和细胞浓度；使用程序降温盒；复苏时快速化冻。
2、冻存管破裂：

原因：冻存管质量差；液体装得太满；从低温取出时物理撞击。 

解决：使用高质量冻存管；预留膨胀空间；轻拿轻放。

希望这份详细的指南能帮助您顺利完成细胞冻存实验！每一步都至关重要，特别是缓慢降温和使用高浓度血清的冻存液。

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